Phương pháp phân biệt vi khuẩn Gram âm và Gram dương

Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi khuẩn thành 2 nhóm. Gram dương (Gram positive) và Gram âm (Gram negative) dựa trên các đặc tính hoá lý của thành tế bào. Phương pháp này được đặt tên theo người phát minh ra nó, nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853 -1938). Ông phát triển kỹ thuật này vào năm 1884, về sau được Hucker và nhiều người khác cải tiến.

NỘI DUNG KỸ THUẬT NHUỘM GRAM VI KHUẨN

Nguyên lý của kỹ thuật nhuộm Gram
Vi khuẩn bắt màu Gram âm hay Gram dương do sự khác nhau về thành phần, cấu trúc vách tế bào của vi khuẩn.
Vi khuẩn Gram dương có lớp peptidoglycan dầy, nhiều acid teichoic, chúng không bị ảnh hưởng bởi sự tẩy màu bằng cồn, vẫn giữ nguyên được màu tím ban đầu nếu vách tế bào không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như tuổi, tác dụng của kháng sinh...
Vi khuẩn Gram âm có một lớp peptidoglycan gắn với lớp phospholipid kép, xen kẽ các protein ở màng ngoài, lớp màng này dễ bị phá hủy bởi cồn khi tẩy màu, do đó phức hợp tinh thể tím gentian - iod không bền, bị tẩy màu và màu được thay bởi các thuốc nhuộm khác.

Dụng cụ, thiết bị
- Tủ an toàn sinh học (ATSH) cấp 2
- Kính hiển vi quang học.
- Máy ly tâm
- Máy trộn, lắc
- Ống vô trùng có nắp đậy.
- Đèn cồn, que cấy, lam kính, lá kính mỏng, bút viết kính, dầu soi kính, giấy thấm dầu.
- Pipet Pasteur vô trùng. 

Vật liệu, hoá chất

(1) Các loài vi khuẩn hoặc các hỗn dịch các vi khuẩn này. Vi khuẩn Gram âm: E.coli, Salmonella,..; Gram dương: S. aureus, Bacillus cereus; dịch cơ thể hoặc mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn.
(2) Dung dịch tím gentians
(3) Dung dịch Lugol
(4) Dung dịch alcohol 90%
(5) Dung dịch fucshin kiềm

Các bước tiến hành kỹ thuật nhuộm Gram

Bước một, dàn tiêu bản và cố định tiêu bản:
Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống thạch nghiêng (hoặc dịch cơ thể, mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn). Hoà vào 1 giọt nước muối sinh lý ở giữa phiến kính, để khô trong phòng thí nghiệm.
Cố định tiêu bản bằng cách hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính. Việc cố định nhằm 3 mục đích: giết chết vi khuẩn, gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính và làm vết bôi bắt màu tốt hơn vì các tế bào chết bắt màu tốt hơn các tế bào sống.

Bước hai, nhuộm màu:

– Thứ nhất, nhuộm bằng dung dịch tím gentians trong 30 giây đến 1 phút, rửa nước;
– Thứ hai, nhuộm thêm dung dịch lugol và giữ trong 1 phút, rửa nước;
– Thứ ba, khử màu: nhỏ dung dịch alcohol 90%, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước;
– Thứ tư, nhuộm tiếp bằng dung dịch Fucshin trong 1 phút, rửa nước, để khô.
* Kết quả: quan sát ở vật kính dầu 100x. Nếu nhuộm đúng vi khuẩn Gram dương bắt màu tím, Gram âm bắt màu hồng.

Giải thích tính bắt màu Gram của vi khuẩn

Vi khuẩn Gram dương có vách tế bào dày từ 15 đến 50 nm, dạng lưới, cấu tạo bởi peptidoglycan. Chất này có khả năng giữ phức hợp tím gentians – iod. Trong khi đó, lớp vách tế bào peptidoglycan của các vi khuẩn Gram âm thì mỏng hơn và thường có thêm lớp màng lipopolysaccharde (LPS) bên ngoài.

Sau khi nhuộm với phức hợp gentians – iod, mẫu được xử lí tiếp với hỗn hợp khử màu, làm mất nước của các lớp peptidoglycan trong vách tế bào Gram dương. Từ đó làm giảm khoảng trống giữa các phân tử và khiến vách tế bào bắt giữ phức hợp gentians – iod bên trong tế bào.
Đối với vi khuẩn Gram âm, dung dịch alcohol 90% đóng vai trò là chất hoà tan lipit và làm tan màng ngoài của vách tế bào. Lớp peptidoglycan mỏng (chỉ khoảng 10 nm) không thể giữ lại phức hợp gentians – iod và tế bào Gram âm bị khử màu và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung.

 Những sai lầm có thể gặp trong phương pháp nhuộm Gram

– Có những sai lầm trong phương pháp nhuộm Gram làm cho vi khuẩn Gram dương nhuộm thành màu hồng của vi khuẩn Gram âm, đó là:

+ Phết vi khuẩn ở lứa cấy qúa già (trên 24h), cấu trúc vách vi khuẩn gram dương không còn bền chặt như ở lứa cấy trẻ, do vậy mất khả năng ngăn cản sự tẩy màu của alcohol.

+ Dung dịch lugol không còn tốt, do đã pha quá lâu và mất đi iod. Trường hợp này có thể nhận biết khi dung dịch lugol không còn sậm màu.

+ Tẩy màu bằng alcohol quá lâu đã làm cho vi khuẩn Gram dương cũng bị tẩy màu.
– Có những sai lầm trong phương pháp nhuộm Gram làm cho vi khuẩn Gram âm nhuộm thành màu tím của vi khuẩn Gram dương, đó là:

+ Phết vi khuẩn quá dầy làm cho alcohol không thể tẩy màu toàn bộ vi khuẩn trong phết nhuộm.

+ Tẩy màu bằng alcohol quá ngắn hay dung dịch alcohol bị pha quá loãng làm cho màu Gram không được tẩy khỏi tế bào vi khuẩn.

HIỆN NAY MELAB DIAGNOSTICS CUNG CẤP BỘ NHUỘM GRAM “MELAB GRAM COLOR SET” GỒM ĐẦY ĐỦ CÁC HÓA CHẤT CẦN THIẾT CHO VIỆC TIẾN HÀNH NHUỘM GRAM VỚI CÁC MẪU BỆNH PHẨM, THỰC PHẨM,...

Tìm hiểu thêm về sản phẩm tại đây: MELAB GRAM COLOR SET

Nhuộm Gram là một phương pháp nhuộm do Gram sáng chế năm 1884. Phương pháp này giúp phân biệt vi khuẩn bắt màu Gram (Gram dương) và vi khuẩn không bắt màu Gram (Gram âm), từ đó giúp cho việc chẩn đoán xác định loại vi khuẩn.

Chuẩn bị thuốc thử

• Dung dịch tím Gentian.
• Dung dịch Lugol.
• Cồn tẩy 950.
• Dung dịch đỏ Fuchsin pha loãng 1/10.

Kỹ thuật nhuộm Gram

(1). Dàn bệnh phẩm hoặc vi khuẩn lên trên lam kính sạch.

(2). Cố định bằng cách hơ qua trên ngọn lửa đèn cồn. Để nguội.

(3). Nhuộm:

• Phủ dung dịch tím Gentian, để khoảng 30 giây. Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ.
• Phủ dung dịch Lugol để cố định màu, để khoảng 30 giây. Rửa dưới vòi nước.
• Tẩy mầu bằng cồn 950, để khoảng 30 giây. Rửa nước.
• Phủ dung dịch đỏ Fucshin 1/10 của Gram, để khoảng 30 giây. Rửa dưới vòi nước.

(4). Để khô tự nhiên.

(5). Soi dưới vật kính dầu.

Nguyên tắc nhuộm

Nhuộm tím Gentian: Nhuộm tất cả vi khuẩn thành màu tím đen.

Nhỏ Lugol: Gắn màu tím vào vi khuẩn đậm hay nhạt tuỳ loại.

Tẩy cồn 950: Tẩy màu một số vi khuẩn mà dung dịch lugol không gắn chắc màu tím vào được. Không tẩy màu một số vi khuẩn mà màu tím đã được dung dịch lugol gắn chắc vào. Bước tẩy cồn rất quan trọng nên phải thật chú ý trong quá trình nhuộm.

Nhuộm đỏ Fuchsin: Nhuộm đỏ trở lại những vi khuẩn đã bị cồn tẩy màu. Không có tác dụng trên vi khuẩn đã bị nhuộm tím đen.

Cơ chế bắt màu Gram

Có sự khác biệt giữa vi khuẩn Gram (+) và vi khuẩn Gram (-) về cấu tạo của lớp peptidoglycan (murein) ở thành tế bào vi khuẩn.

Các vi khuẩn Gram (+) có lớp peptidoglycan dày hơn làm cho vi khuẩn giữ chắc màu tím gentian và không bị tẩy màu bởi cồn. Sau khi nhuộm fuchsin, vi khuẩn không bắt màu đỏ mà vẫn giữ nguyên màu tím, đó là vi khuẩn Gram (+).

Các vi khuẩn Gram (-) có lớp peptidoglycan mỏng hơn làm cho vi khuẩn không giữ được màu tím gentian và bị tẩy màu bởi cồn trở thành không màu. Khi nhuộm fuchsin vi khuẩn bắt màu đỏ, đó là vi khuẩn Gram (-).

Đọc kết quả nhuộm Gram

Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím sẫm Gentian: Tụ cầu, liên cầu, phế cầu, trực khuẩn khuẩn bạch hầu, trực khuẩn than.

Vi khuẩn Gram (-) không bắt màu tím Gentian nên có màu đỏ Fucshin: Lậu cầu, não mô cầu, E. coli, Shigella, Salmonella, tả.

Lưu ý về nguyên nhân nhuộm sai

Gram dương giả

• Do tiêu bản được cố định khi chưa khô, tiêu bản quá dầy.
• Cặn thuốc nhuộm (phải lọc trước khi dùng).
• Đổ chưa hết Lugol.
• Tẩy cồn chưa đủ thời gian.
• Dung dịch fuchsin quá đậm hay nhuộm quá lâu.

Gram âm giả

• Do không thay lugol
• Tẩy cồn quá lâu và tráng không kỹ.

Bệnh viện Bạch Mai

Bài này không có nguồn tham khảo nào. Mời bạn giúp cải thiện bài bằng cách bổ sung các nguồn tham khảo đáng tin cậy. Các nội dung không có nguồn có thể bị nghi ngờ và xóa bỏ. Nếu bài được dịch từ Wikipedia ngôn ngữ khác thì bạn có thể chép nguồn tham khảo bên đó sang đây.

Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi khuẩn thành 2 nhóm (Gram dương và Gram âm) dựa trên các đặc tính hoá lý của thành tế bào.

Vi khuẩn bệnh than nhuộm Gram dương (hình que màu tím) trong mẫu dịch não tuỷ. (Các tế bào khác là bạch cầu.)

Phương pháp này được đặt tên theo người phát minh ra nó, nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853-1938). Ông phát triển kỹ thuật này vào năm 1884 để phân biệt các Pneumococcus với Klebsiella pneumoniae.

Nhuộm Gram được thực hiện trên dịch cơ thể hoặc mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn. Nó cho kết quả nhanh hơn cấy, và có ý nghĩa đặc biệt quan trọng giúp phân biệt bệnh do nhiễm khuẩn với các trường hợp không do nhiễm khuẩn vì điều trị và tiên lượng sẽ khác nhau.

Vi khuẩn Gram dương có thành tế bào dày, dạng lưới cấu tạo bởi peptidoglycan, chất này có khả năng giữ phức hợp tím tinh thể-iod. Trong khi đó, lớp thành tế bào peptidoglycan của các vi khuẩn Gram âm thì mỏng hơn và thường có thêm lớp màng lipopolysaccharide (LPS) bên ngoài.

Sau khi nhuộm với phức hợp tím tinh thể-iod, mẫu được xử lý tiếp với hỗn hợp khử màu, làm mất nước của các lớp peptidoglycan trong thành tế bào Gram dương, từ đó làm giảm khoảng trống giữa các phân tử và khiến thành tế bào bắt giữ phức hợp tím tinh thể-iod bên trong tế bào.

Đối với vi khuẩn Gram âm, hỗn hợp khử màu đóng vai trò là chất hoà tan lipid và làm tan màng ngoài của thành tế bào. Lớp peptidoglycan mỏng không thể giữ lại phức hợp tím tinh thể-iod và tế bào Gram âm bị khử màu. Khử màu là bước quan trọng và cần kĩ năng nhất định vì khả năng bắt màu Gram dương không phải là "tất cả hoặc không."

Theo kinh nghiệm (và có ngoại lệ), bệnh do vi khuẩn Gram âm thường nguy hiểm hơn vì màng ngoài của chúng được bọc bởi một nang, và nang này che các kháng nguyên làm cơ thể phát hiện tác nhân xâm lấn khó khăn hơn. Ngoài ra, màng ngoài vi khuẩn Gram âm có chứa lipopolysaccharide, đóng vai trò là nội độc tố, giải phòng ra khi tế bào vi khuẩn bị tan vỡ và làm tăng độ nặng của phản ứng viêm, có thể gây hội chứng đáp ứng viêm hệ thống (SIRS), sốc nhiễm khuẩn, suy đa tạng. Nhiễm vi khuẩn Gram dương thường ít nguy hiểm hơn vì cơ thể người không có peptidoglycan, và có khả năng sản xuất lysozyme tấn công lớp peptidoglycan nằm ở bên ngoài của vi khuẩn.

1. Làm tiêu bản mẫu cần nhuộm.
2. Cố định mẫu bằng ngọn lửa đèn cồn.
3. Dùng thuốc nhuộm kiềm, tím tinh thể hay tím gentian nhuộm mẫu trong 1 phút.
4. Rửa nước tối đa 5 giây.
5. Thêm dung dịch Lugol (1% iod, 2% KI) trong 1 phút.
6. Rửa bằng rượu trong 10 giây.
7. Phủ lên mẫu với ethanol 95% (hoặc hỗn hợp acetone:ethanol 95% 5:1) vài lần cho đến khi không xuất hiện thêm màu trong mẫu (khoảng 1 phút). Dung dịch này sẽ rửa sạch thuốc nhuộm kiềm không kết gắn, vi khuẩn Gram dương giữ lại màu tím, còn vi khuẩn Gram âm mất màu.
8. Rửa nước.
9. Nhuộm tiếp với safranin hoặc fuchsin. Cả hai nhóm vi khuẩn đều bắt giữ thuốc nhuộm lần này, nhưng vi khuẩn Gram dương không bị thay đổi màu nhiều, trong khi vi khuẩn Gram âm trở nên đỏ vàng (nhuộm safranin) hay đỏ tía (fuchsin). Thời gian: 1 phút theo tài liệu mới nhất.
10. Rửa qua nước. Để khô.

 

Lậu cầu (Neisseria gonorrhoeae) nhìn dưới kính hiển vi sau khi nhuộm Gram

Quan sát lam kính dưới kính hiển vi

• Gram dương: xanh đen hay tím
• Gram âm: đỏ vàng hay đỏ tía.

Vi khuẩn không phân biệt được với phương pháp này được gọi là Gram biến đổi. kính hiển vi

Wikimedia Commons có thêm hình ảnh và phương tiện truyền tải về Nhuộm Gram.

Lấy từ “https://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Nhuộm_Gram&oldid=68257477”