Tóm tắt:
Thốt nốt [Borassus flabellifer L.] hay Thốt lốt được trồng nhiều ở vùng đồng bằng sông Cửu Long đặc biệt là các tỉnh như An Giang, Kiên Giang và Đồng Tháp. Nghiên cứu này nhằm mục đích khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của vỏ trái Thốt nốt, một phụ phẩm được vứt bỏ từ hoạt động kinh doanh thịt quả Thốt nốt thông qua sử dụng các phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa khác nhau như: DPPH, ABTS•+, reducing power [RP], khử sắt [FRAP] và phosphomolybdeum. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng, cao chiết methanol của vỏ trái Thốt nốt thể hiện hoạt tính kháng oxi hóa tốt trong phương pháp ATBS•+, FRAP, Phosphomolybdeum với giá trị EC50 [hoặc OD0,5] thấp hơn hoặc bằng 100 μg/mL. Kết quả này cũng phù hợp với việc xác định hàm lượng tổng flavonoid trong cao chiết methanol của vỏ là khá cao. Kết quả này mở ra triển vọng trong việc sử dụng vỏ trái Thốt nốt như sản phẩm có hoạt tính kháng oxi hóa.
Từ khóa: Borassus flabellifer L. Flavonoid, kháng oxi hóa, phụ phẩm, polyphenol.
1. Mở đầu
Ngày nay, tình trạng stress oxi hóa đang là một trong những vấn đề được quan tâm nhiều của các nhà khoa học bởi vì tác hại nguy hiểm của nó. Tình trạng stress oxi hóa là sự mất cân bằng giữa việc sản xuất các gốc tự do và sự tham gia hoạt động của các chất chống oxi hóa. Stress oxi hóa cũng là nguyên nhân của các bệnh như tim mạch, ung thư, suy giảm thần kinh và gây lão hóa sớm [1]. Nhiều nghiên cứu hiện nay đang tập trung vào việc tìm kiếm các hợp chất chống oxi hóa tự nhiên từ các loài thực vật vì các hợp chất từ tự nhiên này được xem như an toàn cho con người. Thốt nốt [Borassus flabellifer L.] hay Thốt lốt được trồng nhiều ở vùng đồng bằng sông Cửu Long đặc biệt là các tỉnh như An Giang, Kiên Giang, và Đồng Tháp. Bộ phận thường sử dụng là cuống cụm hoa, rễ, dịch cây, thân cây và phần thịt quả [2-4]. Thốt nốt được sử dụng trong y học dân gian như một chất kích thích, chống co thắt, lợi tiểu, chống viêm. Quả có tác dụng an thần, nhuận tràng, khó tiêu, đầy hơi, bệnh ngoài da, xuất huyết, sốt và suy nhược. Rễ và dịch quả có khả năng kháng viêm. Rễ non là thuốc lợi tiểu và chống giun, thuốc sắc của rễ được dùng cho một số bệnh về đường hô hấp. Tro của hoa có khả năng điều trị trầm cảm, các bệnh về tim, lá lách và cảm sốt. Nhựa cây cũng có thể được sử dụng như thuốc nhuận tràng và điều trị loét và các vấn đề về gan [5, 6].
Các nghiên cứu về hoạt tính kháng oxi hóa của cây Thốt nốt đã được thực hiện trên các bộ phân khác nhau của cây. Theo Madhankumar et al. [2019], lá của cây Thốt nốt thể hiện hoạt tính kháng oxi hóa mạnh với hiệu quả gần tương đương với chất chuẩn ở các phương pháp SOD [Superoxide dismutase, 26,4±0,25 units/mg protein], CAT [Catalase, 44,58±2,36 µmol H2O2 tiêu thụ/phút/mg proteins], GPx [Glutathione peroxidase, 231,4±1,46 µg glutathione bị oxi hóa/phút/mg protein] và GST [Glutathione-s-transferase, 153,1±1,43 µmol CDNB-GSH được hình thành/phút/mg protein] [7]. Nghiên cứu của Pramod et al. [2013] cho thấy hoạt tính kháng oxi hóa của thịt quả Thốt nốt trong phương pháp DPPH và ABTS•+ có sự tương quan với hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng có chứa trong cao chiết [8]. Cao chiết cồn của hoa Thốt nốt theo nghiên cứu của Kavatagimath et al. [2016] cũng có hoạt tính kháng oxi hóa tương đương chất chuẩn BHT ở phương pháp DPPH và còn có khả năng hạ đường huyết rất tốt [9]. Ngoài ra, với nguồn giá trị dinh dưỡng cao, Thốt nốt được người dân khai thác và kinh doanh nhiều, đặc biệt là phần thịt quả với hàm lượng chất dinh dưỡng đến 1398kJ/100g và chứa khá nhiều carbohydrate, protein, chất xơ và các chất khoáng như kali, canxi, ma-giê [10]. Tuy nhiên, khi khai thác sử dụng phần thịt quả, phần phụ phẩm tức là phần vỏ sẽ bị bỏ đi. Theo tìm hiểu của chúng tôi tại một số cơ sở kinh doanh Thốt nốt ở ĐBSCL, phần vỏ phụ phẩm này chưa có cách xử lý, chỉ phơi khô dùng làm nguyên liệu đốt. Chính vì thế, nghiên cứu này lựa chọn phần vỏ quả Thốt nốt làm đối tượng nghiên cứu hoạt tính kháng oxi hóa, nhằm mục đích tăng thêm giá trị sử dụng của phụ phẩm vỏ trái thốt nốt.
2. Thực nghiệm
2.1. Nguyên liệu
Trái Thốt nốt được thu mua tại các cơ sở kinh doanh các sản phẩm thốt nốt tại huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang vào tháng 5 năm 2019. Mẫu trái được xác nhận bởi ThS. Phùng Thị Hằng và được lưu trữ tại Phòng thí nghiệm Hóa sinh học, bộ môn Hóa học, khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ, với mã số AG_Bo2019050002. Nguyên liệu sau khi mua về được gọt lấy phần vỏ trái phía ngoài, rửa sạch, loại bỏ tạp bẩn, cắt nhỏ. Mẫu được sấy ở 50°C và xay thành bột.
2.2. Xác định độ ẩm bột nguyên liệu
Độ ẩm bột nguyên liệu được xác định theo Dược điển Việt Nam V, theo phương pháp sấy [11].
2.3. Điều chế cao chiết
Bột khô vỏ trái Thốt nốt được chiết với dung môi methanol bằng phương pháp ngâm trong 24 giờ [3 lần]. Tất cả dịch chiết được gom lại và lọc để loại bỏ cặn, bụi. Dịch chiết sau khi lọc đem cô quay đuổi dung môi ở nhiệt độ 40-45°C thu được cao chiết methanol vỏ trái Thốt nốt. Cao chiết được đem cân và tính hiệu suất chiết cao, sau đó cao được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4°C cho đến khi thí nghiệm.
2.4. Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của cao chiết
2.4.1. Khảo sát hiệu quả loại bỏ gốc tự do DPPH
Khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của cao chiết được được thực hiện theo Sharma et al. [2009] có hiệu chỉnh [12]. Hỗn hợp phản ứng gồm 40 µL DPPH [1000 µg/mL] và 960 µL cao chiết có nồng độ khác nhau từ 30-150 µg/mL. Hỗn hợp được ủ trong tối ở nhiệt độ 30ºC trong thời gian 30 phút, đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 517 nm. Chất chuẩn được sử dụng là vitamin C. Kết quả hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết được biểu diễn bằng giá trị EC50 [Effective Concentration of 50%] được tính dựa trên phương trình tuyến tính của dịch chiết khảo sát. Phần trăm loại bỏ gốc tự do được tính theo công thức:
Trong đó: AC là giá trị hấp thu của đối chứng, AS hấp thu của mẫu.
2.4.2. Khảo sát hiệu quả loại bỏ gốc tự do ABTS•+
Hoạt động loại bỏ gốc tự do ABTS•+ thực hiện theo Nenadis et al. [2004] có hiệu chỉnh [13]. Chuẩn bị dung dịch ABTS•+: 2 mL dung dịch ABTS 7 mM và 2 mL dung dịch K2S2O8 2,45 mM, ủ trong bóng tối 16 giờ, sau đó pha loãng bằng ethanol [khoảng 30 lần], điều chỉnh độ hấp thu ở bước sóng 734 nm đạt 0,7±0,05. Tiến hành cho 990 µL ABTS•+ vào 10 µL cao chiết ở các nồng độ khác nhau từ 20-100 µg/mL. Hỗn hợp phản ứng được ủ trong thời gian 6 phút. Sau đó, đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 734 nm. Chất chuẩn được sử dụng là trolox. Kết quả hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết được biểu diễn bằng giá trị EC50 được tính dựa trên phương trình tuyến tính của dịch chiết khảo sát. Phần trăm làm sạch gốc tự do được tính theo công thức:
Trong đó: AC là giá trị hấp thu của đối chứng, AS hấp thu của mẫu.
2.4.3. Khảo sát năng lực khử [Reducing Power - RP]
Năng lực khử [RP] được thực hiện theo phương pháp Ferreira et al. [2007] có hiệu chỉnh [14]. Hỗn hợp phản ứng gồm 0,5 mL cao chiết ở nồng độ khác nhau từ 100-700 μg/mL, 0,5 mL dung dịch đệm phosphate [0,2M, pH=6,6] và 0,5 mL K3Fe[CN]6 1%. Sau đó hỗn hợp phản ứng được ủ ở 50ºC trong 20 phút, thêm 0,5 mL CCl3COOH 10% rồi ly tâm 3.000 vòng/phút trong 10 phút. Nhẹ nhàng rút 0,5 mL dịch phía trên cho vào 0,5 mL nước và 0,1 mL FeCl3 0,1%, lắc đều. Đo độ hấp thụ quang phổ của hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 700 nm. Chất đối chứng dương sử dụng là trolox. Hiệu quả kháng oxy hóa của cao chiết ở các nồng độ khác nhau được so sánh với chất chuẩn bằng cách sử dụng nồng độ mà tại đó chất chuẩn hay cao chiết [µg/mL] có giá trị OD=0,5 [OD0,5] cũng như hàm lượng tương đương chất kháng oxy hóa μg/mL chất chuẩn.
2.4.4. Khảo sát khả năng khử sắt [FRAP]
Khả năng khử sắt FRAP được thực hiện theo Benzie et al. [1996] có hiệu chỉnh [15]. Tiến hành cho 10 µL cao chiết [có nồng độ từ 10-50 µg/mL] vào 990 µL dung dịch FRAP. Các hỗn hợp trên được ủ ở 37°C trong 10 phút, sau đó tiến hành đo giá trị độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 593 nm. Chất chuẩn sử dụng là trolox. Hiệu quả kháng oxy hóa của cao chiết ở các nồng độ khác nhau được so sánh với chất chuẩn bằng cách sử dụng nồng độ mà tại đó chất chuẩn hay cao chiết [µg/mL] có giá trị OD=0,5 [OD0,5].
2.4.5. Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa tổng [Phương pháp phosphomolybdenum]
Phương pháp dựa trên sự khử của Mo[VI] về Mo[V] thể hiện qua sự tạo phức Mo[V]-Phosphate màu xanh lá ở pH acid theo Prieto et al. [1999] [16]. Tiến hành cho 100 µL cao chiết nồng độ khác nhau từ 45-315 µg/mL vào dung dịch phosphomolybdenum. Các hỗn hợp trên được ủ ở 95°C trong 90 phút, sau đó tiến hành đo giá trị độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 695 nm. Chất chuẩn sử dụng là vitamin C. Hiệu quả kháng oxy hóa của cao chiết ở các nồng độ khác nhau được so sánh với chất chuẩn bằng cách sử dụng nồng độ mà tại đó chất chuẩn hay cao chiết [µg/mL] có giá trị OD=0,5 [OD0,5].
2.5. Định lượng polyphenol tổng và flavonoid tổng trong cao chiết
Hàm lượng polyphenol tổng được xác định bằng thuốc thử Folin-Ciocalteu theo mô tả của Rebaya et al. [2014] có hiệu chỉnh [17]. Hàm lượng flavonoid tổng trong cao chiết được xác định theo phương pháp so màu AlCl3 của Bag et al. [2015] [18].
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Độ ẩm bột nguyên liệu và hiệu suất chiết cao
Độ ẩm bột nguyên liệu vỏ trái Thốt nốt đạt 4,918±0,028%, với giá trị độ ẩm này là khá thấp và phù hợp với tiêu chuẩn bột dược liệu của Dược điển Việt Nam [độ ẩm bột nguyên liệu